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介紹ELISA實(shí)驗(yàn)注意三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)

日期:2022-01-20 11:04:24 by
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優(yōu)化ELISA的重點(diǎn)之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號(hào),從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留,在最后一步產(chǎn)生信號(hào)。而不充分的洗滌會(huì)導(dǎo)致差異和高背景,從而帶來(lái)不理想的結(jié)果。本文將為你介紹一些利用自動(dòng)洗板機(jī)來(lái)洗滌ELISA平板的技巧。

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免疫分析,比如ELISA,一般包含兩個(gè)或以上的孵育步驟,中間以洗滌隔開(kāi)。ELISA通常在96孔板中開(kāi)展,其上包被了結(jié)合抗原或抗體。在封閉步驟后,包被后的平板首先與一抗或抗原孵育。隨后通過(guò)一些洗滌步驟去除未結(jié)合(低親和力)的抗原-抗體復(fù)合物。接著,平板與二抗孵育。這種帶有酶的抗體與高親和力的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。之后,又是一輪洗滌。最后是添加底物并檢測(cè)信號(hào)。

我們可使用多種底物來(lái)檢測(cè)最終的抗原-抗體復(fù)合物。底物分為三類:自然發(fā)光、化學(xué)發(fā)光和熒光。準(zhǔn)確說(shuō)來(lái),ELISA這個(gè)詞指的是使用自然發(fā)光底物的分析。而使用化學(xué)發(fā)光底物的分析被稱為L(zhǎng)uminescent Immunoassay(LIA),使用熒光二抗的分析被稱為Fluorescent Immunoassay(FIA)。

洗滌參數(shù):

第一個(gè)主要的參數(shù)是洗滌量。自動(dòng)洗板機(jī)會(huì)分配洗滌液。如果你之前遭遇過(guò)高背景,那么不要猶豫,將洗滌量調(diào)為高,最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會(huì)讓一部分分析表面洗滌不到,從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同。

ELISA板的制造商通常會(huì)在試劑盒的使用手冊(cè)中列出包被量。行業(yè)中通常使用的包被量是200μl。如果你的試劑盒也是這樣,那么制造商可能會(huì)建議使用300μl洗滌液進(jìn)行洗滌,以便清潔整個(gè)反應(yīng)孔的壁。一般來(lái)說(shuō),洗滌量越高,則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。

洗滌次數(shù):

第二個(gè)影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量。當(dāng)然,洗滌次數(shù)越多,背景越低。然而,太多次的洗滌會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度,使其難以測(cè)定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。不過(guò),ELISA板的制造商會(huì)對(duì)洗滌次數(shù)提出建議。一般而言,制造商包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對(duì)于用戶包被的ELISA板,必須優(yōu)化洗滌次數(shù)。

控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過(guò)量的洗滌液。一般來(lái)說(shuō),96孔板的每個(gè)孔能容納330至460 μl。不過(guò),有些自動(dòng)化洗板機(jī)可設(shè)置程序,分配遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出這個(gè)量的洗滌液,比如1 ml。它是如何做到的呢?其實(shí)很簡(jiǎn)單,就是在分液的同時(shí)打開(kāi)吸液功能。換句話說(shuō),隨著分液器分配更多的液體,抽吸器也將液體吸出。這種技術(shù)能增加洗滌量,但不會(huì)溢出到其他孔中。              抽吸:

另外,還有一些參數(shù)會(huì)影響洗滌步驟的效果。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置,這兩者都能調(diào)整,以降低背景(殘留量)和差異。

殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體,它們會(huì)增加背景信號(hào)。殘留量越小,殘留液體越少,轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少。

吸液高度會(huì)明顯影響殘留量;如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大,那就會(huì)讓殘留量急劇增加。反之,如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部,那么也會(huì)使吸液效率降低,殘留量增加。

目前的洗板機(jī)一般使用兩種類型的洗頭:剛性和浮動(dòng)。浮動(dòng)洗頭中的吸頭可在洗滌過(guò)程中自由上下移動(dòng),而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢谩J褂脛傂韵搭^的洗滌操作在優(yōu)化起來(lái)更為復(fù)雜,因?yàn)槟阈枰浅W屑?xì)地調(diào)整吸液高度。如果你們實(shí)驗(yàn)室使用幾種不同的板,那可能會(huì)很耗時(shí)。在使用浮動(dòng)洗頭時(shí),吸頭會(huì)降到反應(yīng)孔的底部。調(diào)整高度就不是很重要,因此洗頭會(huì)下降到底部。

抽吸的位置也對(duì)殘留量有著重要影響;如果每個(gè)孔只使用一個(gè)抽吸點(diǎn)(這很常見(jiàn),因?yàn)楦欤?,那么抽吸的位置需要?yōu)化。最佳的位置取決于洗頭的性狀,但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間,即使這是所有洗頭最常見(jiàn)的默認(rèn)位置。一般來(lái)說(shuō),最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。

反應(yīng)孔的形狀也會(huì)影響殘留量。C形底(平底圓角)的微孔板一般會(huì)比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。

如果沒(méi)有自動(dòng)洗板機(jī),采用手工洗滌,那么也需要注意幾點(diǎn)。使用8道或12道微量移液器,采用倒吸的方法進(jìn)行洗滌;不同廠家的洗液不宜相互混用。洗板時(shí)需保證微孔板平放,將洗滌液注滿各孔,但盡量避免漏液溢液,以每孔300 μl為宜;板洗次數(shù)一般為3次,要保證洗板的浸泡時(shí)間,每次浸泡時(shí)間一般為30-60 秒;盡量減少洗液殘留量,推薦每次洗板后進(jìn)行拍板,并及時(shí)更換吸水紙,避免吸水紙的碎屑粘到反應(yīng)孔內(nèi)。

ELISA看起來(lái)很簡(jiǎn)單,但是在實(shí)際操作過(guò)程中,也不能掉以輕心,還是應(yīng)該仔細(xì)檢查洗滌步驟,才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。



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